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    學會這6步，輕松搞定transwell實驗

    發布時間： 2021-11-02　　點擊次數： 1972次
    做腫瘤研究的人，很少有不知道 transwell 實驗的，它是用來研究腫瘤細胞的遷移侵襲轉移情況的一種簡便快捷的實驗方法，還可以構建兩種細胞的共培養體系以及趨化性試驗。今天咱們就來講講怎么做腫瘤細胞的侵襲轉移實驗。



    Transwell 侵襲實驗，其實原理簡單地說，就是用一層膜將高營養的培養液和低營養的培養液隔開，細胞放在低營養的培養液里，為了找吃的，細胞會往高營養的培養液里面跑，但是有膜擋著，所以要穿過膜才行。

    我們在膜上涂上一層基質膠，模仿細胞外基質，于是細胞就要分泌金屬蛋白酶將基質消化了才可以從低營養的培養液跑到高營養的培養液里面，最后我們檢測高營養的培養液里細胞量就可以知道細胞的侵襲能力了。而遷移實驗就是不鋪膠直接讓細胞穿過就行了。

    圖片
    Transwell 簡易圖

    以下就來為大家介紹侵襲實驗步驟：




    實驗前準備：transwell 小室（一般選用 12um），24 孔板，基質膠（corning），細胞實驗所需的基本的材料。

     

    1

        
    基質膠鋪板

    用 Matrigel 1：8 稀釋（可以直接用無血清的培養基稀釋），包被 Transwell 小室底部膜的上室面，置 37℃孵箱 1-4h 使 Matrigel 聚合成凝膠（時間不宜太長，之前有人說在 37 度孵箱過夜，反正元元師兄覺得不太可能）。




    注意事項：




    1. 鋪膠之前將槍頭以及所用的耗材至于冰箱 4 度當中，否則配膠的時候會直接凝固。
    2. 鋪膠的厚度自己摸索，25ul，40ul，100ul。
    3. 注意鋪膠過程不要產生氣泡，鋪膠均勻，否則影響實驗結果。
    4. 注意無菌操作。

     

    2

        
    制作細胞懸液

    1. 制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓 12－24h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。
    2. 消化細胞，終止消化后離心棄去培養液，（用 PBS 洗 1－2 遍，這一步很必要，否則細胞表面覆有血清培養基，細胞沒有遷移侵襲的動力），用無血清培養基重懸。

     

    3

        
    接種細胞

    1. 細胞懸液 200µl 加入 Transwell 小室（腫瘤細胞數目需要摸濃度，從 2 萬，5 萬，10 萬）。
    2. 24 孔板下室一般加入 600µl 含 15%FBS 的培養基，特別注意的是，下層培養液和小室間常會有氣泡產生，一旦產生氣泡，下層培養液的趨化作用就減弱甚至消失。在種板的時候要特別留心，一旦出現氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養板。
    3. 養細胞：常規培養 12－48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。24h 較常見，時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數目的影響也不可忽視。

     

    4

        
    固定染色

    取出 Transwell 小室，棄去孔中培養液，用無鈣的 PBS 洗 2 遍，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，甲醇或者甲醛固定 30 分鐘，將小室適當風干。用 0.1% 結晶紫染色 30-60 min，用 PBS 洗 3 遍。用棉簽輕輕擦掉上室水分。

     

    5

        
    計數

    400 倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細胞，記數。




    如果細胞怎么還是穿不過去。總結一下幾個原因：
    1.  細胞不具備侵襲轉移的能力（例如 MCF7 為非轉移性的細胞）
    2.  基質膠鋪的太厚了 (基質膠的稀釋倍數是可以改的，基質膠的量是可以摸的)
    3.  細胞給的量太少了（200ul 里 2 萬細胞太少，給 5 萬，10 萬，20 萬唄）
    4.  細胞沒有進行預處理（這步可以免），也沒有用 PBS 洗兩遍 (這一步不可省，因為你用胰酶消化后，含血清的培養基中和，必須洗干凈了。
    5.  上層的培養基為無血清培養基，下室的培養基為 15% 的血清培養基，這個濃度可以改成 20%，細胞數不夠，底下的吸引力也不夠不行哈。
    6.  細胞的活性太差，半死不活的細胞做侵襲實驗傷不起哈。



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