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    大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)實驗——機(jī)械性劃割培養(yǎng)

    發(fā)布時間： 2021-12-05　　點(diǎn)擊次數(shù)： 974次

    材料與儀器

    SD大鼠
    硼酸硼砂緩沖液 胰酶-EDTA 消化液 D-Hanks’
    眼科剪 滴管 離心機(jī) 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱

    步驟


    一、實驗步驟
     
    1. 孕16 d SD 大鼠經(jīng)戊巴（匕匕）妥鈉麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮膚，依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜，無菌操作下取出胚胎放入預(yù)冷的D-Hanks’平衡鹽液中。
     
    2. 在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱內(nèi)消化20 min，中間搖晃一次。
     
    3. 隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的培養(yǎng)液(DMEM＋10%FBS)的離心管內(nèi)終止消化液作用5 min。
     
    4. 用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的 DMEM＋10%FBS 的離心管內(nèi)，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟 2～3 次。
     
    5. 將所收集的上清經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾。
     
    6. 過濾后的細(xì)胞懸液于800 rpm 離心5 min，棄上清，管內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液(DMEM＋20%FBS)并吹打 成單細(xì)胞懸液。
     
    7. 細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度按1.5x105/cm2  種入6 孔板內(nèi)，放入CO2 孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后換液并 加入Ara-C使其終濃度為 1x10-5 mM/L。Ara-C作用24 h 后全量換液。以后每隔 3 天半量換液一次。


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