步驟

一、原代培養(yǎng)

1. 取手術切除或早期活檢組織，將組織放入轉運培養(yǎng)液（Leibowitz L-15培養(yǎng)液，添加 100 μg/ml 慶大霉素、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素和 1μg/ml     2性霉素B），盡快送到實驗室。

2. 將組織移入 100 mm 培養(yǎng)皿，用 P-PBSA （不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Dulbecco PBSA）浸洗。

3. 盡量切除結締組織和有血液部分。如果組織標本的表面面積 ≥1 cm2，將其切成小塊。

4. 將組織塊放入 35 mm 培養(yǎng)皿，然后加入足夠 0.17 % 胰蛋白酶液（用 P-PBSA 配制），覆蓋組織塊。在 4°C 條件下孵育過夜。

5. 用一把鑷固定組織塊，用另一把鑷將上皮剝離入胰蛋白酶液。

6. 將組織懸液輕輕研磨幾次，使細胞進一步分散。然后，將細胞懸液移入離心管。

7. 用 D-PBSA 浸洗培養(yǎng)皿，然后將浸洗液加入細胞懸液。浸洗用量同步驟 4 組織消化的胰蛋白酶液。

8. 用微吸管吸取一等份測定細胞產量。

9. 在4°C 條件下離心（125 g），最好用制冷離心機。用生長培養(yǎng)液混懸細胞。

10. 按要求用含抗菌索的生長培養(yǎng)液（生長培養(yǎng)液添加 100 μg/ml 慶大霉素、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素和 1 μg/ml   2性霉素B）稀釋細胞懸液，然后將細胞接種于涂有 FN/C/BSA 的 50 mm 培養(yǎng)皿，密度為 5×103 個/cm2。

11. 24 h 后換培養(yǎng)液，以除去細胞碎片和紅細胞。

12. 隔天換液。

二、傳代培養(yǎng)

13. 用 D-PBSA 浸洗細胞。

14. 加入 PET 液（含有 1 % 聚乙烯吡咯酮（PVP，40 KDa）、0.5 mmol/L EGTA 和 0.025 % 胰蛋白酶，用 D-PBSA 配制），完-全覆蓋細胞，如在 100 mm 培養(yǎng)皿加入3 ml。

15. 在室溫下孵育，直至細胞變圓或從培養(yǎng)皿去附著。在顯微鏡下觀察細胞去附著情況，此過程一般需要 1.5 min。可通過加入高濃度胰蛋白酶或在 37°C 條件下消化提高去附著效率。

16. 當大多數(shù)細胞去附著時，輕彈培養(yǎng)皿和用胰蛋白酶液吹打細胞，以機械性地加強去附著。

17. 細胞去附著后，向培養(yǎng)皿加入 5~10 ml D-PBSA，終止胰蛋白酶的消化。

18. 將細胞懸液注入離心管，輕輕研磨，以使細胞充分混懸。

19. 用 1 ml 吸管取細胞懸液，加入血細胞計數(shù)板，計數(shù)細胞。

20. 計算懸液中細胞密度。

21. 在 4°C 條件下離心（125 g，5 min）。

22. 吸去上清液，用手指輕彈離心管，直至沉下的細胞分散。

23. 加入適量生長培養(yǎng)液，用吸管輕輕混懸細胞，然后將細胞懸液注入培養(yǎng)皿。

24. 將全部培養(yǎng)皿放入淺盤內，用手移動淺盤，并變化移動方向，從而搖動培養(yǎng)皿。注意保證每個培養(yǎng)皿中的細胞密度均勻，即搖動培養(yǎng)皿時集中于培養(yǎng)皿中心。另外，應注意將放培養(yǎng)皿的架平坦固定于孵育箱，孵育箱不能振動，以免細胞在貼壁過程中分布不均勻。

25. 將細胞靜置孵育 4~24 h，然后換培養(yǎng)液。